手足口病（Hand-foot-mouth Disease, HFMD）是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，是我國法定報(bào)告管理的丙類傳染病。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。少數(shù)患者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，可導(dǎo)致死亡。手足口病常出現(xiàn)暴發(fā)或流行，為指導(dǎo)各地做好手足口病的預(yù)防控制工作，制定本指南。

　　一、目的

　　（一）指導(dǎo)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)開展疫情報(bào)告與監(jiān)測(cè)。

　?。ǘ┲笇?dǎo)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)開展流行病學(xué)調(diào)查、病原學(xué)監(jiān)測(cè)。

　　（三）指導(dǎo)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展重點(diǎn)場(chǎng)所及公眾預(yù)防控制工作。

　　二、疾病概述

　　（一）病原學(xué)。

　　引起手足口病的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組（Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等，B組（Coxasckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等；腸道病毒71型（Human Enterovirus 71, EV71）；?？刹《荆‥chovirus, ECHO）等。其中以EV71及CVA16型較為常見。

　　腸道病毒適合在濕、熱的環(huán)境下生存與傳播，75%酒精和5%來蘇不能將其滅活，對(duì)乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感；對(duì)紫外線和干燥敏感，各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛、碘酒以及56℃30分鐘可以滅活病毒。病毒在4℃可存活1年，-20℃可長(zhǎng)期保存，在外環(huán)境中可長(zhǎng)期存活。

　?。ǘ┝餍胁W(xué)。

　　1．傳染源。人是人腸道病毒的唯一宿主，患者和隱性感染者均為本病的傳染源，隱性感染者難以鑒別和發(fā)現(xiàn)。發(fā)病前數(shù)天，感染者咽部與糞便就可檢出病毒，通常以發(fā)病后一周內(nèi)傳染性最強(qiáng)。

　　2．傳播途徑。腸道病毒可經(jīng)胃腸道（糞-口途徑）傳播，也可經(jīng)呼吸道（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、皮膚或粘膜皰疹液及被污染的手及物品等造成傳播。尚不能明確是否可經(jīng)水或食物傳播。

　　3．易感性。人對(duì)人腸道病毒普遍易感。不同年齡組均可感染發(fā)病，以5歲及以下兒童為主，尤以3歲及以下兒童發(fā)病率最高。顯性感染和隱性感染后均可獲得特異性免疫力，產(chǎn)生的中和抗體可在體內(nèi)存留較長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)同血清型病毒產(chǎn)生比較牢固的免疫力，但不同血清型間鮮有交叉免疫。

　　4．流行特征。該病流行無明顯的地區(qū)性，全年均可發(fā)生，一般5-7月為發(fā)病高峰。托幼機(jī)構(gòu)等易感人群集中單位可發(fā)生暴發(fā)。腸道病毒傳染性強(qiáng)、隱性感染比例大、傳播途徑復(fù)雜、傳播速度快，控制難度大，容易出現(xiàn)暴發(fā)和短時(shí)間內(nèi)較大范圍流行。

　　（三）臨床表現(xiàn)。

　　手足口病潛伏期為2-10天，平均3-5天，病程一般為7-10天。

　　急性起病，發(fā)熱，口腔粘膜出現(xiàn)散在皰疹，手、足和臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，皰疹周圍可有炎性紅暈，皰內(nèi)液體較少?？砂橛锌人浴⒘魈?、食欲不振等癥狀。部分患者無發(fā)熱，僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹。一般預(yù)后良好；少數(shù)病例，特別是EV71感染患兒，可出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、神經(jīng)源性肺水腫、循環(huán)障礙等，病情兇險(xiǎn)，可致死亡或留有后遺癥。

　?。ㄋ模┲委熢瓌t。

　　目前無特異性治療方法，以支持療法為主，絕大多數(shù)患者可自愈。目前尚無特異性的疫苗。病例的治療方法參考衛(wèi)生部《手足口病診療指南（2008年版）》。

　　三、病例定義

　?。ㄒ唬┡R床診斷病例。

　　在流行季節(jié)發(fā)病，常見于學(xué)齡前兒童，嬰幼兒多見。

　　1．普通病例：發(fā)熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無發(fā)熱。

　　2．重癥病例：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累、呼吸及循環(huán)功能障礙等表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室檢查可有外周血白細(xì)胞增高、腦脊液異常、血糖增高，腦電圖、腦脊髓磁共振、胸部X線、超聲心動(dòng)圖檢查可有異常。

　　極少數(shù)重癥病例皮疹不典型，臨床診斷困難，需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)做出診斷。

　　若無皮疹，臨床不宜診斷為手足口病。

　　（二）實(shí)驗(yàn)室確診病例。

　　臨床診斷病例符合下列條件之一者，即可診斷為實(shí)驗(yàn)室確診病例：

　　1．自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子、腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本中分離到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導(dǎo)致手足口病的人腸道病毒）。

　　2．自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標(biāo)本中檢測(cè)到CVA16 或EV71特異性核酸，或從腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本等標(biāo)本中檢測(cè)到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導(dǎo)致手足口病的人腸道病毒）的特異性核酸。

　　3．血清標(biāo)本人腸道病毒型特異性中和抗體滴度≥1∶256，或急性期與恢復(fù)期血清腸道病毒特異性中和抗體有4倍或4倍以上的升高。

　?。ㄈ┚奂圆±?。

　　1周內(nèi)，同一托幼機(jī)構(gòu)或?qū)W校等集體單位發(fā)生5例及以上手足口病病例；或同一班級(jí)（或宿舍）發(fā)生2例及以上手足口病病例；或同一自然村發(fā)生3例及以上手足口病病例；或同一家庭發(fā)生2例及以上手足口病病例。

　　四、疾病監(jiān)測(cè)

　?。ㄒ唬┮咔閳?bào)告。

　　1．個(gè)案報(bào)告。各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)按照《中華人民共和國傳染病防治法》和《傳染病信息報(bào)告管理規(guī)范》的有關(guān)規(guī)定，對(duì)符合病例定義的手足口病病例進(jìn)行報(bào)告。

　　如為重癥病例，請(qǐng)?jiān)凇爸匕Y患者”處選擇“是”；如為實(shí)驗(yàn)室診斷病例，請(qǐng)?jiān)凇皩?shí)驗(yàn)室結(jié)果”處選擇相應(yīng)的腸道病毒病原學(xué)分型信息。

　　實(shí)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)于24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)，未實(shí)行網(wǎng)絡(luò)直報(bào)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)于24小時(shí)之內(nèi)寄送出傳染病報(bào)告卡。

　　2．聚集性病例報(bào)告。托幼機(jī)構(gòu)和學(xué)校、醫(yī)療機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)手足口病聚集性病例時(shí)，應(yīng)以最快的方式向縣（區(qū)）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)報(bào)告。

　　3. 突發(fā)公共衛(wèi)生事件報(bào)告。局部地區(qū)或集體單位發(fā)生流行或暴發(fā)時(shí)，按照《突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急條例》、《全國突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急預(yù)案》、《突發(fā)公共衛(wèi)生事件與傳染病疫情監(jiān)測(cè)信息報(bào)告管理辦法》及有關(guān)規(guī)定，及時(shí)進(jìn)行突發(fā)公共衛(wèi)生事件信息報(bào)告。

　?。ǘ┎≡瓕W(xué)監(jiān)測(cè)。

　　各省區(qū)市衛(wèi)生行政部門要組織醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)開展病原學(xué)監(jiān)測(cè)，了解病原動(dòng)態(tài)分布變化。所有重癥和死亡病例均需采樣。此外，以縣（區(qū)）為單位，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標(biāo)本；當(dāng)月縣（區(qū)）病例總數(shù)少于5例時(shí)，全部采樣。

　　以?。▍^(qū)、市）為單位,在手足口病流行年份中每年至少采集20對(duì)EV71 和10對(duì)CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清,以闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。

　　以?。▍^(qū)、市）為單位，每月至少從手足口病病例中分離10株毒株并做血清型別鑒定，鑒定完成后并將毒株及鑒定結(jié)果于5個(gè)工作日內(nèi)報(bào)送至中國疾病預(yù)防控制中心。具備測(cè)序條件的省份，可開展VP1基因序列測(cè)定和分析，進(jìn)行基因定型，序列測(cè)定完成后將序列結(jié)果于5個(gè)工作日內(nèi)報(bào)送至中國疾病預(yù)防控制中心；不具備測(cè)序條件者，將毒株送至中國疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行序列測(cè)定，中國疾病預(yù)防控制中心要于28個(gè)工作日內(nèi)反饋基因定型結(jié)果。

　　所有病例的采樣均由醫(yī)療機(jī)構(gòu)完成，及時(shí)送至縣（區(qū)）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)或指定的檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)。檢測(cè)機(jī)構(gòu)將實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果于24小時(shí)內(nèi)反饋給縣（區(qū)）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)；縣（區(qū)）級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)接到結(jié)果后，于24小時(shí)內(nèi)對(duì)檢測(cè)病例的傳染病報(bào)告卡信息進(jìn)行訂正，將其病例類型訂正為“實(shí)驗(yàn)室診斷”，并在“實(shí)驗(yàn)室結(jié)果”處補(bǔ)填腸道病毒病原學(xué)分型信息。

　　各種標(biāo)本采集和檢測(cè)方法詳見《手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案》（附件1）。

　?。ㄈ┍O(jiān)測(cè)信息分析與反饋。

　　各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)要每日對(duì)網(wǎng)絡(luò)直報(bào)系統(tǒng)進(jìn)行瀏覽，及時(shí)對(duì)報(bào)告的病例進(jìn)行審核、查重、訂正等工作，定期對(duì)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，判斷發(fā)病趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)異常升高或病例呈聚集性分布或出現(xiàn)重癥及死亡病例時(shí)，要及時(shí)核實(shí)并向同級(jí)衛(wèi)生行政部門及上級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)報(bào)告，并定期向下級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)反饋疫情分析信息。

　　五、預(yù)防控制

　　（一）現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查處置。

　　發(fā)現(xiàn)手足口病聚集性病例、重癥或死亡時(shí)，縣（區(qū)）級(jí)及以上疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)要立即組織開展現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查處置。

　　1．流行病學(xué)調(diào)查。

　?。?）聚集性病例調(diào)查：了解聚集性病例的臨床表現(xiàn)、流行特征，以分析流行因素，為采取防控措施提供依據(jù)。要對(duì)首發(fā)或指示病例開展流行病學(xué)調(diào)查，填寫《手足口病個(gè)案調(diào)查表》（附件2）。

　?。?）重癥或死亡病例調(diào)查：詳細(xì)了解病例的基本信息、臨床癥狀、發(fā)病就診治療過程、感染傳播情況、病原檢測(cè)結(jié)果，以分析重癥及死亡病例的主要危險(xiǎn)因素，填寫《手足口病重癥或死亡病例個(gè)案調(diào)查表》（附件3）。調(diào)查結(jié)束后，各省級(jí)疾病預(yù)防控制中心應(yīng)將結(jié)果錄入統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫，報(bào)送中國疾病預(yù)防控制中心。

　　（3）專題調(diào)查：根據(jù)當(dāng)?shù)?a target='_blank'>手足口病疫情特點(diǎn)及流行特征，可開展專題調(diào)查，以了解當(dāng)?shù)氐闹饕獋鞑シ绞揭约案腥疚ｋU(xiǎn)因素等，為制定干預(yù)措施提供依據(jù)。專題調(diào)查的方案及其內(nèi)容，應(yīng)根據(jù)調(diào)查目的專門設(shè)計(jì)。

　?。?）醫(yī)療機(jī)構(gòu)要協(xié)助疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)對(duì)病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。

　　2．傳染源的管理。

　　患兒應(yīng)及時(shí)就醫(yī)，并遵醫(yī)囑采取居家或住院方式進(jìn)行治療。居家患兒，家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人應(yīng)在社區(qū)（村）醫(yī)生的指導(dǎo)下，密切關(guān)注患兒的病情變化，如發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等相關(guān)癥狀時(shí)，應(yīng)立即送醫(yī)院就診，同時(shí)，要盡量避免與其他兒童接觸。住院患兒應(yīng)在指定區(qū)域內(nèi)接受治療，防止與其他患兒發(fā)生交叉感染。

　　管理時(shí)限為自患兒被發(fā)現(xiàn)起至癥狀消失后1周。

　　鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院/社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心、村衛(wèi)生室/社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站等負(fù)責(zé)本轄區(qū)居家治療的手足口病患兒的隨訪工作，掌握居家治療患兒的病情進(jìn)展情況。

　　3．標(biāo)本采集和檢測(cè)。

　　（1）所有重癥和死亡病例均要采集標(biāo)本，可以采集咽拭子、糞便或肛拭子、皰疹液、腦脊液、血清等，死亡病例還可采集腦、肺、腸淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。聚集性病例至少要采集2例病例標(biāo)本開展病原學(xué)檢測(cè)。

　?。?）醫(yī)療機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)樣本采集，疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)指導(dǎo)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)標(biāo)本的采集。

　?。?）疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)根據(jù)本地的技術(shù)能力，對(duì)采集的標(biāo)本開展核酸檢測(cè)、病毒分離；不具備技術(shù)條件時(shí)，及時(shí)送上級(jí)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)（附件1）。

　　4．消毒措施。

　　病家、托幼機(jī)構(gòu)和小學(xué)的消毒應(yīng)在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)下，由單位及時(shí)進(jìn)行消毒，或由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)對(duì)其進(jìn)行消毒處理。醫(yī)療機(jī)構(gòu)的消毒由醫(yī)療機(jī)構(gòu)安排專人進(jìn)行。消毒方法參見《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002版）和《手足口病疫源地消毒指南》（附件4）。

　　5．健康教育。

　　各級(jí)醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)應(yīng)在政府領(lǐng)導(dǎo)下，與當(dāng)?shù)亟逃?、宣傳、廣電等部門密切合作，充分利用12320公共衛(wèi)生公益熱線、廣播、電視、報(bào)紙、網(wǎng)絡(luò)、手機(jī)短信、宣傳單/宣傳畫等多種方式，開展手足口病防治知識(shí)的宣傳工作，使5歲以下兒童家長(zhǎng)及托幼機(jī)構(gòu)工作人員等了解手足口病的臨床癥狀，掌握最基本的預(yù)防措施，強(qiáng)調(diào)保持良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣及環(huán)境衛(wèi)生措施對(duì)于有效預(yù)防手足口病的重要性，動(dòng)員托幼機(jī)構(gòu)老師和管理人員、兒童家長(zhǎng)成為手足口病防控工作的主動(dòng)參與者，形成群防群控。與重癥或死亡病例發(fā)病前1周或發(fā)病后有共同生活、居住史的5歲以下兒童，要對(duì)其家長(zhǎng)或監(jiān)護(hù)人進(jìn)行健康教育，做好兒童的密切觀察，出現(xiàn)癥狀要及時(shí)就診和治療。

　?。ǘ┲攸c(diǎn)人群及重點(diǎn)機(jī)構(gòu)的預(yù)防控制措施。

　　為降低人群手足口病的發(fā)病率，減少聚集性病例，避免醫(yī)院感染，各地要做好以散居兒童為主的重點(diǎn)人群和以托幼機(jī)構(gòu)、醫(yī)療機(jī)構(gòu)為主的重點(diǎn)場(chǎng)所的預(yù)防控制工作。

　　1．散居兒童的預(yù)防控制措施。

　?。?）飯前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等給兒童洗手；看護(hù)人接觸兒童前、替幼童更換尿布、處理糞便后均要洗手；

　?。?）嬰幼兒的尿布要及時(shí)清洗、曝曬或消毒；注意保持家庭環(huán)境衛(wèi)生，居室要經(jīng)常通風(fēng)，勤曬衣被；

　?。?）嬰幼兒使用的奶瓶、奶嘴及兒童使用的餐具使用前后應(yīng)充分清洗、消毒；不要讓兒童喝生水、吃生冷食物；

　?。?）本病流行期間不宜帶兒童到人群聚集、空氣流通差的公共場(chǎng)所；避免接觸患病兒童；

　?。?）兒童出現(xiàn)發(fā)熱、出疹等相關(guān)癥狀要及時(shí)到醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診；

　?。?）居家治療的患兒避免與其他兒童接觸，以減少交叉感染；父母要及時(shí)對(duì)患兒的衣物進(jìn)行晾曬或消毒，對(duì)患兒糞便及時(shí)進(jìn)行消毒處理。

　　2．托幼機(jī)構(gòu)預(yù)防控制措施。

　?。?）每日進(jìn)行晨檢，發(fā)現(xiàn)可疑患兒時(shí)，要采取立即送診、居家觀察等措施；對(duì)患兒所用的物品要立即進(jìn)行消毒處理；

　?。?）出現(xiàn)重癥或死亡病例，或1周內(nèi)同一班級(jí)出現(xiàn)2例及以上病例，建議病例所在班級(jí)停課10天；1周內(nèi)累計(jì)出現(xiàn)10例及以上或3個(gè)班級(jí)分別出現(xiàn)2例及以上病例時(shí)，經(jīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后，可建議托幼機(jī)構(gòu)停課10天；

　?。?）教育、指導(dǎo)兒童養(yǎng)成正確洗手等良好的衛(wèi)生習(xí)慣；老師要保持良好的個(gè)人衛(wèi)生狀況；

　?。?）教室和宿舍等場(chǎng)所要保持良好通風(fēng)；定期對(duì)玩具、兒童個(gè)人衛(wèi)生用具（水杯、毛巾等）、餐具等物品進(jìn)行清洗消毒；

　?。?）定期對(duì)活動(dòng)室、寢室、教室、門把手、樓梯扶手、桌面等物體表面進(jìn)行擦拭消毒；

　?。?）托幼機(jī)構(gòu)應(yīng)每日對(duì)廁所進(jìn)行清掃、消毒，工作人員應(yīng)戴手套，工作結(jié)束后應(yīng)立即洗手；

　　（7）托幼機(jī)構(gòu)應(yīng)配合衛(wèi)生部門采取手足口病防控措施。

　　3．醫(yī)療機(jī)構(gòu)的預(yù)防控制措施。

　　（1）各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)預(yù)檢分診，專辟診室（臺(tái)）接診發(fā)熱、出疹的病例。增加候診及就診等區(qū)域的清潔消毒頻次，室內(nèi)清掃時(shí)應(yīng)采用濕式清潔方式；

　?。?）醫(yī)務(wù)人員在診療、護(hù)理每一位病例后，均應(yīng)認(rèn)真洗手或?qū)﹄p手消毒，或更換使用一次性手套；

　?。?）診療、護(hù)理手足口病病例過程中所使用的非一次性儀器、體溫計(jì)及其他物品等要及時(shí)消毒；

　?。?）對(duì)住院患兒使用過的病床及桌椅等設(shè)施和物品必須消毒后才能繼續(xù)使用；

　　（5）患兒的呼吸道分泌物和糞便及其污染的物品要進(jìn)行消毒處理。

　　附件：1．手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案

　　2．手足口病個(gè)案調(diào)查表

　　3．手足口病重癥或死亡病例個(gè)案調(diào)查表

　　4．手足口病疫源地消毒指南

　　附件1

　　手足口病標(biāo)本采集及檢測(cè)技術(shù)方案

　　一、采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸

　?。ㄒ唬┘S便標(biāo)本。

　　采集病人發(fā)病3日內(nèi)的糞便標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。糞便標(biāo)本采集量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內(nèi)，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽，4℃暫存12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-70℃冰箱。

　　（二）咽拭子標(biāo)本。

　　采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。4℃暫存并在12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于-70℃冰箱。

　　（三）血清標(biāo)本。

　　各?。▍^(qū)、市）在手足口病流行年份中均應(yīng)采集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復(fù)期（發(fā)病14-30d）雙份配對(duì)血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。將血清置于-20℃以下冰箱中冷凍保存。

　　（四）皰疹液。

　　在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標(biāo)本。先用75%的酒精對(duì)皰疹周圍的皮膚進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內(nèi)裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。所采集標(biāo)本4℃暫存立即（12h內(nèi)）送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。

　?。ㄎ澹└厥米訕?biāo)本。

　　采集病人發(fā)病3日內(nèi)的肛拭子標(biāo)本，用于病原檢測(cè)。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有3－5ml保存液（含5%牛血清細(xì)胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。

　　（六）尸檢標(biāo)本。

　　采集腦、肺和腸淋巴結(jié)等重要組織標(biāo)本，每一采集部位分別使用單獨(dú)的消毒器械。每種組織應(yīng)多部位取材，每部位應(yīng)取2-3份約5-10g的組織，淋巴結(jié)2個(gè)，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識(shí)別號(hào)碼的標(biāo)簽。

　?。ㄆ撸┠X脊液標(biāo)本。

　　出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標(biāo)本，進(jìn)行病毒分離或核酸檢測(cè)。采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內(nèi)，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內(nèi))送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(zhǎng)期保存的標(biāo)本存于－70℃冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，很難在腦脊液中檢測(cè)到EV71病原。

　　臨床標(biāo)本在運(yùn)輸和貯存過程中要避免反復(fù)凍融。標(biāo)本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運(yùn)輸，12小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。依照《人間傳染的病原微生物名錄》，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標(biāo)本按B類包裝，置于冷藏保存盒內(nèi)運(yùn)輸，盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間?？刹捎藐懧坊蚝娇盏榷喾N運(yùn)輸方式，但在運(yùn)輸過程中應(yīng)采取保護(hù)措施，避免強(qiáng)烈震動(dòng)、重力擠壓等現(xiàn)象。在送到省、地、市級(jí)CDC實(shí)驗(yàn)室時(shí)，包裝盒內(nèi)應(yīng)帶冰且包裝完整。在上送標(biāo)本的同時(shí)，需附帶相關(guān)的《手足口病病例臨床標(biāo)本采樣登記表》。

　　二、標(biāo)本采集注意事項(xiàng)

　　在手足口病的實(shí)驗(yàn)室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。用于采集咽拭子的無菌拭子要放在標(biāo)本保存液中，如含5%牛血清維持液。用于分子生物學(xué)診斷的標(biāo)本采集與病毒分離標(biāo)本的采集方法一樣。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性，標(biāo)本應(yīng)在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測(cè)。不能立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)冷凍保存。對(duì)于血清學(xué)診斷，急性期血清應(yīng)該在發(fā)病后盡早采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病兩周后采集。標(biāo)本保存液的配置見下表：

　　 保存液

　　Eagle`s液(MEM) 80.5ml

　　3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml

　　胎牛血清 5.0ml

　　7.5%NaHCO3溶液 3.5ml

　　青、鏈霉素

　?。ǜ?0000U/ml） 10ml

　　三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作流程

　?。ㄒ唬┎《痉蛛x。

　　1.試劑配置

　　（1）細(xì)胞的生長(zhǎng)液、維持液的配制見下表：

　　 生長(zhǎng)液（GM） 維持液（MM）

　　Eagle`s液(MEM) 86.5ml 92.5ml

　　3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml

　　胎牛血清 10.0ml 2.0ml

　　7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml

　　青、鏈霉素

　?。ǜ?0000U/ml） 1.0ml 1.0ml

　?。?）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理液

　　完全PBS液中加入P．S溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100μg/ ml。

　　完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。

　　A液：

　　試劑品名 加入量

　　NACL 8.00g

　　KCL 0.20g

　　Na2HPO4(無水) 0.91g

　　KH2PO4 0.12g

　　用600～800ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補(bǔ)至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。

　　B液：

　　試劑品名 加入量

　　MgCl2.6H2O 0.10g

　　溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。

　　C液：

　　試劑品名 加入量

　　CaCl2 0.10g

　　溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。

　　2．病毒分離細(xì)胞系

　　許多細(xì)胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長(zhǎng)。

　　對(duì)于檢測(cè)手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標(biāo)本均需接種到以下兩種細(xì)胞系：

　　? RD細(xì)胞，來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞。

　　? HEp-2細(xì)胞，來源于人喉癌上皮細(xì)胞。

　　3．標(biāo)本的處理

　?。?）糞便標(biāo)本和肛拭子的處理

　　操作步驟：

　　1）在離心管上標(biāo)記標(biāo)本號(hào)；

　　2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

　　3）在生物安全柜中將每一份糞便標(biāo)本取大約2g加入標(biāo)記好的離心管中（確保離心管上的標(biāo)號(hào)與原始標(biāo)本的標(biāo)號(hào)一致）；肛拭子為2ml；

　　4）剩余的原始標(biāo)本最好留在原容器中，凍存于－20℃；

　　5）確保擰緊離心管，用機(jī)械震蕩器劇烈震蕩20min；

　　6）在確保離心機(jī)的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機(jī)在1500g條件下離心20min；

　　7）在生物安全柜中將每1份標(biāo)本的上清液分別吸入2個(gè)有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應(yīng)再用氯仿處理1次）；

　　8） 1管糞便懸液凍存于－20℃作為備份，另1管存于4-8℃以備接種。

　?。?）皰疹液標(biāo)本的處理

　　皰疹液標(biāo)本通常直接用于RNA提取或病毒分離。

　?。?）腦脊液標(biāo)本的處理

　　腦脊液標(biāo)本通常直接用于病毒分離。

　　（4）咽拭子標(biāo)本的處理

　　咽拭子要在標(biāo)本運(yùn)輸（保存）液中充分?jǐn)噭?dòng)（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，用于病毒分離時(shí)，需要凍融一次（防止多次凍融），使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細(xì)胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌污染，須用濾器過濾除菌。

　　4．接種和觀察（病毒分離）

　?。?）通常使用８ml的斜面試管培養(yǎng)細(xì)胞，傳細(xì)胞時(shí)，每管加細(xì)胞培養(yǎng)液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細(xì)胞，以確保細(xì)胞是健康、無污染的。一個(gè)健康的單層細(xì)胞會(huì)在傳代后48小時(shí)左右形成；

　?。?）倒掉生長(zhǎng)液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；

　?。?）每一份標(biāo)本需要同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞，正確標(biāo)記每支細(xì)胞培養(yǎng)管（包括標(biāo)本的編號(hào)、日期、傳代數(shù)）；

　?。?）每一種細(xì)胞至少標(biāo)記一管作為陰性對(duì)照；

　?。?）每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度要求36℃。

　?。ɑ蛘呤褂梦降姆椒ń臃N病毒：接種標(biāo)本前，倒掉生長(zhǎng)液（GM），每支試管接種0.2ml的標(biāo)本懸液，培養(yǎng)溫度為36℃；吸附1小時(shí)后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標(biāo)本需同時(shí)接種2支RD細(xì)胞和2支HEp-2細(xì)胞。

　?。?）使用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的出現(xiàn)（如細(xì)胞變圓，折光增強(qiáng)并脫離管壁等）；

　?。?）記錄接種管和對(duì)照管細(xì)胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+—4+）、提示細(xì)胞受毒性反應(yīng)、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；

　　（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實(shí)記錄，并觀察直到75%的細(xì)胞發(fā)生變化（3+ CPE），然后儲(chǔ)藏在－20℃以備二次傳代；

　?。?）第一代培養(yǎng)見可疑細(xì)胞病變時(shí)應(yīng)繼續(xù)傳代，待細(xì)胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后－20℃或－70℃凍存；

　?。?0）一代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以選用二代病毒進(jìn)行鑒定；

　　（11）如果7d之后沒有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7d。（注意：同一病例標(biāo)本的細(xì)胞培養(yǎng)物不能混在一起再傳代，例如：不同細(xì)胞的培養(yǎng)物應(yīng)單獨(dú)傳代）；

　?。?2）盲傳兩代后，仍然沒有出現(xiàn)CPE的，則判定為陰性；

　?。?3）注意：如果接種后24h內(nèi)出現(xiàn)CPE，很可能是標(biāo)本中的非特異性成分導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。取100μl陽性分離物傳二代，繼續(xù)觀察；或者在接種標(biāo)本吸咐1h后用維持液清洗細(xì)胞層，可能會(huì)降低毒性反應(yīng)；

　　（14）幾個(gè)概念：

　　A：毒性反應(yīng)：如果在接種后1-2d內(nèi)細(xì)胞快速凋亡，這可能是由于標(biāo)本中含有毒性物質(zhì)而導(dǎo)致的非特異性毒性反應(yīng)。這些已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細(xì)胞中（此時(shí)是第二代）。如果又出現(xiàn)了毒性反應(yīng)，那么應(yīng)該取原始標(biāo)本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細(xì)胞中。這時(shí)應(yīng)被認(rèn)為是第一代。

　　B：微生物污染：由于細(xì)菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細(xì)胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現(xiàn)。重新取原始標(biāo)本，用氯仿或抗生素處理，按上述步驟重新接種到新鮮細(xì)胞上。

　　C：盲傳：有時(shí)一周之后傳代細(xì)胞會(huì)老化，甚至細(xì)胞對(duì)照也出現(xiàn)了病變。這時(shí)已接種標(biāo)本的試管應(yīng)在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型的新鮮單層細(xì)胞中，再觀察7-10d。如果盲傳兩代后仍然沒有產(chǎn)生CPE，那么認(rèn)為這個(gè)標(biāo)本是陰性的。

　　5．病毒分離結(jié)果解釋

　　RD細(xì)胞支持HFMD的主要病原體——CVA16和EV71等多種腸道病毒的復(fù)制，CVA16和EV71均能在RD細(xì)胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、分散、胞漿內(nèi)顆粒增加，最后細(xì)胞自管壁脫落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD細(xì)胞中生長(zhǎng)的速度不同，EV71的生長(zhǎng)速度要快于CVA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細(xì)胞后出現(xiàn)CPE的時(shí)間比CVA16早，EV71接種細(xì)胞后出現(xiàn)CPE很快，但CVA16一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。

　　若在使用RD細(xì)胞分離的同時(shí)再增加HEp-2細(xì)胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2細(xì)胞中均不繁殖。

　?。ǘy(cè)定人雙份血清標(biāo)本的中和抗體滴度。

　　比較患者急性期血清與恢復(fù)期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學(xué)診斷方法，最常用的是中和實(shí)驗(yàn)，即用微量板法測(cè)定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測(cè)的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。

　　作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測(cè)定血清中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復(fù)期血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，腸道病毒隱性感染也很常見，所以在評(píng)估檢測(cè)結(jié)果時(shí)就要小心一些。在中和實(shí)驗(yàn)中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CVA16原型株為G-10株）或流行株，有時(shí)同時(shí)（或單獨(dú)）使用臨床分離株會(huì)有助于得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

　　使用對(duì)腸道病毒敏感的細(xì)胞，如RD細(xì)胞。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因?yàn)槭怯貌《緛泶_定血清中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時(shí)使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，但分離株的滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先測(cè)定。

　　中和實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)原理：病毒感染敏感靶細(xì)胞后，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，出現(xiàn)CPE，特異性中和抗體與病毒結(jié)合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現(xiàn)。

　　1．液體配制

　　A液：血清處理液：（100ml中含下列試劑成份）

　　MEM 85ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　胎牛血清 2ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 10ml

　　B液：細(xì)胞營養(yǎng)液：（按生長(zhǎng)液配方配制，100ml中含下列試劑成份）

　　MEM 85ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　HEPES 1ml

　　胎牛血清 10ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml

　　C液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體）

　　MEM 93ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　HEPES 1ml

　　胎牛血清 2ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml

　　2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備

　?。?）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于10支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應(yīng)在一次試驗(yàn)中用完，有剩余應(yīng)高壓后廢棄；

　?。?）加Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細(xì)胞板內(nèi)，每孔50μl，每稀釋度4孔細(xì)胞；

　?。?）每孔加細(xì)胞懸液50μl，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照（50μl稀釋液+50μl細(xì)胞懸液）， 36℃培養(yǎng)7d，觀察細(xì)胞病變；

　　（4）按Behrens-K?rber公式計(jì)算出分離病毒株的CCID50；

　　log CCID50 = L-d (S-0.5)，其中：

　　L = 實(shí)驗(yàn)中使用的最低稀釋度的對(duì)數(shù)值；

　　d = 稀釋梯度的對(duì)數(shù)值；

　　S = 終判時(shí)陽性部分的總和（即出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔所占的比例之和）。

　　（5）正式試驗(yàn)前應(yīng)先滴定攻擊病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒載量；

　?。?）按照計(jì)算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗(yàn)所需的病毒總量（即100 CCID50/0.05ml）；

　?。?）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml；

　　（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經(jīng)稀釋好的攻擊病毒液（即100CCID50/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。

　　3．稀釋血清

　?。?）發(fā)病1-3d內(nèi)采取患者急性期血清，發(fā)病后2-4周采取恢復(fù)期血清，分別凍存在-20℃?zhèn)錂z。

　?。?）取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測(cè)血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。

　?。?）打開獨(dú)立無菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取處理過的血清0.1ml加入第一孔（即為1：16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過程中不必更換吸尖。即每份血清標(biāo)本進(jìn)行4倍倍比稀釋，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。

　　（4）每份血清標(biāo)本的每個(gè)稀釋度都要平行做兩孔。

　　4．病毒中和抗體測(cè)定的操作步驟：

　?。?）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對(duì)）待測(cè)血清，版面設(shè)計(jì)如下圖所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，不必更換吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測(cè)血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測(cè)血清對(duì)照孔，每孔中補(bǔ)加稀釋液0.05ml；

　　（2）上述孔中分別加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為100 CCID50/0.05ml）；

　?。?）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；

　?。?）另取一塊96孔板縱向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核實(shí)（每次實(shí)驗(yàn)都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05ml，然后從0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個(gè)稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同時(shí)留出4孔做為細(xì)胞對(duì)照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱中暫存；

　?。?）在孵育期間，用消化液消化細(xì)胞，準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液的濃度為2×105個(gè)/ml，每塊96孔板至少需要準(zhǔn)備10ml；

　?。?）孵育結(jié)束后每個(gè)待測(cè)血清孔、血清對(duì)照孔（待檢標(biāo)本板）和病毒回滴孔和細(xì)胞對(duì)照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細(xì)胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育培養(yǎng)；

　?。?）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結(jié)果，以不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點(diǎn)效價(jià)。當(dāng)100 CCID50/0.05ml的病毒對(duì)照孔出現(xiàn)完全病變時(shí)，判定最終結(jié)果（約5~7d）；

　?。?）注意：如果病毒對(duì)照結(jié)果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml的范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)無效，就要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

　　5．結(jié)果判定

　　當(dāng)最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計(jì)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)1孔細(xì)胞病變，另1孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標(biāo)本的中和抗體效價(jià)。

　　對(duì)于HFMD的雙份血清中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果來說，如果恢復(fù)期血清較急性期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復(fù)期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實(shí)該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽性。

　　（三）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。

　　1．RNA提取

　　可使用多種商業(yè)化試劑盒來提取RNA，針對(duì)臨床標(biāo)本應(yīng)選擇質(zhì)量較高的“用于臨床標(biāo)本病毒RNA提取的試劑盒”，也可使用全自動(dòng)RNA提取儀進(jìn)行提取。針對(duì)病毒分離物，核酸提取比較容易，大部分商業(yè)化RNA提取試劑盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依據(jù)使用的試劑不同，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

　　2．逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

　?。?）引物序列合成

　　國家脊灰實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)3對(duì)引物，分別為人腸道病毒通用引物、EV71特異性引物和CVA16特異性引物。各省CDC依據(jù)引物序列在質(zhì)量有保證的公司合成,引物合成后,需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)，保證引物合成沒有質(zhì)量問題后,分發(fā)給地市級(jí)CDC。

　　1）人腸道病毒（包括EV71、CVA16）核酸檢測(cè)通用引物序列：

　　PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`

　　PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`

　　2）EV71核酸檢測(cè)引物序列：

　　EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`

　　EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`

　　3）CVA16核酸檢測(cè)引物序列：

　　CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`

　　CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`

　　（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　1）在PCR記錄紙（實(shí)驗(yàn)記錄紙）上記錄本次實(shí)驗(yàn)操作者姓名，實(shí)驗(yàn)日期，所鑒定標(biāo)本的名稱以及標(biāo)本的順序，與PCR儀排列的順序一致。

　　2）標(biāo)記好加標(biāo)本和對(duì)照的PCR管（陽性對(duì)照，陰性對(duì)照和試劑對(duì)照）。

　　A：陽性對(duì)照：參比RNA，省級(jí)CDC提供（只是在初次使用，常規(guī)不建議使用，以防污染）。

　　B：陰性對(duì)照：使用正常細(xì)胞RNA或臨床標(biāo)本腸道病毒陰性的RNA（每次實(shí)驗(yàn)要設(shè)立）。

　　C：試劑對(duì)照：用去離子水代替標(biāo)本（試劑初次使用時(shí)必須做）。

　?。?）RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)和條件

　　1）從臨床標(biāo)本或病毒中提取的RNA和各種RT-PCR試劑應(yīng)該一直放在冰浴盒上；

　　2）配下列試劑主溶液：

　　10×PCR Buffer???????????????????????????????????????????????????????????????????5.0μl

　　dNTPs（2.5mM each）???????????????????????????????????????????????????????2.0μl

　　上游引物（0.1μg/μl）?????????????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　下游引物（0.1μg/μl）?????????????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　RNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）??????????????????????????????????????0.5μl

　　Taq DNA聚合酶（5U/μl）?????????????????????????????????????????????????0.5μl

　　AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（10U/μl）??????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　模板RNA??????????????????????????????????????????????????????????????????????????3.0μl

　　RNase Free dH2O???????????????????????????????????????????????????????????36.0μl

　　 50.0μl

　　3）在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟如下：

　　42℃????????????????????????45min

　　95℃????????????????????????3min

　　95℃????????????????????????20s

　　45℃????????????????????????25s ×32個(gè)循環(huán)

　　72℃????????????????????????30s

　　72℃????????????????????????10min

　　4℃????????????????????????Soak

　　3．電泳分析

　?。?）將已經(jīng)聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上；

　　（2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 電泳載樣緩沖液（每個(gè)反應(yīng)需1μl）。再加上5μl的PCR反應(yīng)產(chǎn)物與之混合；

　　（3）將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液的混合溶液加到孔中；

　?。?）蓋上蓋子，接通電源，以10V/cm電壓（恒定電壓）電泳，大約35-40min，直到溴酚藍(lán)跑到凝膠的底部的時(shí)候，停止電泳；

　　（5）將膠取出，并注意保持凝膠的方向；

　?。?）在1μg/ml的溴化乙錠溶液中染色15min，

　　注意：溴化乙錠溶液是有毒、致畸、并且致腫瘤的物質(zhì)，操作時(shí)要加小心，并戴雙層手套。如果儲(chǔ)存在避光的容器中，溴化乙錠溶液可以重復(fù)使用。溴化乙錠廢棄物按醫(yī)療廢棄物中化學(xué)品的有關(guān)規(guī)定處理。

　　（7）在蒸餾水中涮一下凝膠；

　?。?）在紫外透射儀下觀察PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，并照相作記錄。

　　有條件的實(shí)驗(yàn)室可以使用全自動(dòng)電泳分析儀。

　　4．結(jié)果解釋

　　使用全自動(dòng)電泳分析儀的實(shí)驗(yàn)室可以通過儀器自動(dòng)讀取PCR產(chǎn)物大小，來判斷結(jié)果。通過瓊脂糖凝膠做PCR產(chǎn)物電泳的實(shí)驗(yàn)室，需要參照DNA分子量對(duì)照對(duì)照，比較標(biāo)本的PCR產(chǎn)物與陽性對(duì)照的PCR產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來解釋結(jié)果。

　　RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋表

　　待檢標(biāo)本RT-PCR結(jié)果 鑒定結(jié)果

　　HEV(-), EV71(-), CVA16(-) 非腸道病毒（NEV）

　　HEV(+), EV71(-), CVA16(-) 非EV71、CVA16的其它腸道病毒

　　HEV(+), EV71(+), CVA16(-) EV71

　　HEV(+), EV71(-), CVA16(+) CVA16

　　(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

　　1. 病毒核酸提取

　　參考常規(guī)RT-PCR病毒核酸提取步驟和注意事項(xiàng)。

　　2. Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

　　依據(jù)不同廠家的試劑盒，嚴(yán)格按相應(yīng)說明書操作和判斷結(jié)果。有5種試劑盒，分別為One Step Real-time PCR法檢測(cè)EV71病毒核酸（單通道檢測(cè)）；One Step Real-time PCR法檢測(cè)CVA16核酸（單通道檢測(cè)）；One Step Real-time PCR法檢測(cè)腸道病毒核酸（單通道檢測(cè)）；One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測(cè)EV71和CVA16核酸（雙通道檢測(cè)）；One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測(cè)EV71和腸道病毒核酸（雙通道檢測(cè)）。下面舉2個(gè)例子來說明單通道檢測(cè)和雙通道檢測(cè)的操作規(guī)程和注意事項(xiàng)。

　?。?） One Step Real-time PCR法檢測(cè)EV71病毒核酸（單通道檢測(cè)）

　?、俜磻?yīng)體系配置：反應(yīng)體系共25μl，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5μl的RNA模板量），不夠部分以水補(bǔ)足。如選用另外試劑盒，反應(yīng)體系及條件隨之變化。

　　a.從試劑盒中取出相應(yīng)的試劑，反應(yīng)液在室溫融化后，瞬時(shí)離心，按n+1配置反應(yīng)體系（n=樣本數(shù)+1管陽性對(duì)照+1管陰性對(duì)照），每個(gè)測(cè)量反應(yīng)體系配置如下表：

　　試劑組成 1份樣品的量

　　熒光RT-PCR反應(yīng)液 12.5μl

　　逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5μl

　　Taq酶 0.5μl

　　引物和探針 1.5μl

　　H2O 5μl

　　b.將上述反應(yīng)液混勻離心后，按照每管20μL分裝于各熒光PCR儀適用的PCR管中。

　　c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應(yīng)管中，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補(bǔ)足?？偡磻?yīng)體積25μL。

　?、跓晒?a href='http://www.feimall.com.cn/html/795308931.html' target='_blank'>RT-PCR循環(huán)條件設(shè)置

　　程序 循環(huán)數(shù) 溫度（攝氏度） 反應(yīng)時(shí)間（分鐘：秒）

　　1 1 42℃ 30min

　　2 1 95℃ 2min

　　3 40 95℃ 10sec

　　 60℃ 35sec

　　 60℃時(shí)收集熒光信號(hào)

　?、蹖?duì)照設(shè)置

　　陰性對(duì)照：核酸提取時(shí)以滅菌雙蒸水代替標(biāo)本，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立。

　　陽性對(duì)照：由省級(jí)實(shí)驗(yàn)室提供EV71陽性核酸（只在評(píng)價(jià)試劑時(shí)使用）

　?、芙Y(jié)果分析條件設(shè)定和結(jié)果判斷

　　閾值設(shè)定

　　原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。

　　Ct值≤35.0的樣本為陽性。

　　38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。

　　Ct值≥38.0的樣本或無數(shù)值的標(biāo)本為陰性。

　?。?） One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測(cè)EV71和CVA16核酸（雙通道檢測(cè)）

　　雙通道可以同時(shí)檢測(cè)EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短時(shí)間(2.5小時(shí))內(nèi)檢測(cè)到標(biāo)本中是否含EV71或CVA16核酸。

　?、俜磻?yīng)體系配置

　　反應(yīng)體系共25μl，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5μl模板量），不夠部分以水補(bǔ)足。如選用另外試劑盒，反應(yīng)體系及條件隨之變化。

　　a.先將試劑解凍，從試劑盒中取出相應(yīng)的試劑，反應(yīng)液在室溫融化后，瞬時(shí)離心，按n+1配置25μl反應(yīng)體系（n=樣本數(shù)+1管陽性對(duì)照+1管陰性對(duì)照），每個(gè)測(cè)量反應(yīng)體系配置如下表：

　　b.將下述反應(yīng)液混勻離心后，按照每管20μL分裝于適用的PCR管中。

　　試劑組成 1份樣品的量

　　熒光RT-PCR反應(yīng)液 12.5μl

　　逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5μl

　　Taq酶 0.5μl

　　引物和探針 3μl

　　H2O 3.5μl

　　c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應(yīng)管中，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標(biāo)本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補(bǔ)足?？偡磻?yīng)體積25μL。

　?、跓晒?a href='http://www.feimall.com.cn/html/795308931.html' target='_blank'>RT-PCR循環(huán)條件設(shè)置

　　程序 循環(huán)數(shù) 溫度（攝氏度） 反應(yīng)時(shí)間

　　1 1 42℃ 30 min

　　2 1 95℃ 2 min

　　3 40 95℃ 10 s

　　 60℃ 35 s

　　 60℃時(shí)收集熒光信號(hào)

　?、劢Y(jié)果分析條件設(shè)定和結(jié)果判斷

　　陰性對(duì)照：核酸提取時(shí)以滅菌雙蒸水代替標(biāo)本。

　　陽性對(duì)照：提取好的陽性核酸作為模板RNA。

　　閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。

　　Ct值≤35.0的樣本為陽性。

　　Ct值無數(shù)值的標(biāo)本和Ct值≥38.0的樣本為陰性樣本。

　　38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。

　　注：熒光PCR同時(shí)讀取FAM和HEX，進(jìn)行雙通道檢測(cè)，F(xiàn)AM熒光Ct值為CVA16的結(jié)果，HEX熒光 Ct值為EV71的結(jié)果。

　　四、生物安全

　　根據(jù)2006年1月11日衛(wèi)生部制定的《人間傳染的病原微生物名錄》，柯薩奇病毒、?？刹《?、EV71型和目前分類未定的其他腸道病毒均屬于危害程度第三類的病原微生物。因此在保證安全的前提下，對(duì)臨床和現(xiàn)場(chǎng)的未知樣本檢測(cè)操作可在生物安全I(xiàn)I級(jí)或以上防護(hù)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，涉及病毒分離培養(yǎng)的操作，應(yīng)加強(qiáng)個(gè)體防護(hù)和環(huán)境保護(hù)。

　　操作糞便、腦脊液和血液等臨床標(biāo)本時(shí)要特別注意生物安全，要在II級(jí)生物安全柜中進(jìn)行標(biāo)本處理、病毒分離和病毒鑒定，無脊灰疫苗免疫史的人員要進(jìn)行脊灰疫苗免疫。

　　滅活后的血清抗體檢測(cè)與PCR檢測(cè)可在生物安全I(xiàn)級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

　　所有操作應(yīng)遵守國家相關(guān)法律法規(guī)。